Després de la perfusió crioprotectora, un pacient no es posa simplement en nitrogen líquid.
El pacient segueix un programa de temperatura controlat per ordinador que dura diversos dies. Els sensors dins del pacient indiquen si les diferents regions anatòmiques es refreden alhora o es separen en gradients tèrmics perillosos.
El problema d'enginyeria canvia durant el descens. El refredament inicial hauria de limitar la formació de gel. A prop i per sota de la transició vítria, la precisió i la uniformitat tèrmica esdevenen més importants que la velocitat.
Per què el refredament controlat és necessari
Els agents crioprotectors redueixen la velocitat de refredament necessària per evitar el gel. Permeten que els teixits rics en aigua entrin en un estat altament viscós, semblant al vidre, en comptes de cristal·litzar-se extensament.
La temperatura de transició vítria rellevant, escrita Tg, depèn de la solució, la seva concentració i el mètode de mesura. És un interval, no un sol llindar biològic universal.
Per a solucions rellevants en la criopreservació humana, aquesta regió sol estar propera a -120°C a -135°C.
Per sobre d'aquesta regió, refredar massa lentament pot permetre la nucleació i el creixement de gel. Per sota, el material es comporta cada cop més com un sòlid fràgil.
Si la superfície es refreda molt més ràpidament que el centre, diferents regions es contrauen en quantitats diferents. L'estrès termomecànic resultant pot produir esquerdes.
Això crea un camí restringit: refreda prou ràpidament abans de la vitrificació, i després controla els gradients i la velocitat de refredament mentre el pacient esdevé semblant al vidre.
Vegeula diferència entre congelació i vitrificació per al comportament de fase subjacent.
La primera caixa de refrigeració de primera generació
La primera caixa de refrigeració de Tomorrow.bio, anomenada V1 cooling box, va establir l'arquitectura bàsica per al refredament controlat de tot el cos.
El pacient es col·loca dins d'una cambra aïllada dedicada. Un ordinador controla l'entorn criogènic de la cambra mentre els termoparells mesuren les temperatures en múltiples ubicacions.
El controlador segueix una corba programada en comptes d'aplicar el refredament màxim de manera contínua. Cada canal de sensor queda enregistrat com a part de la història tèrmica del pacient.
Això ja és fonamentalment diferent de la immersió directa. La màquina pot alentir, mantenir o canviar les condicions de la cambra en resposta al que realment li passa al pacient.
El sistema de segona generació basat en dewars
El disseny de segona generació de Tomorrow.bio trasllada el refredament controlat a un dipòsit construït amb aquest propòsit.
El pacient roman dins del dipòsit mentre una tapa especialitzada integra el maquinari de refredament, els controls informàtics, les vàlvules, les connexions dels sensors i els passamurs dels termoparells.
Els termoparells estan col·locats en diversos punts dins del pacient. Sensors addicionals monitoren l’entorn tèrmic dins del dipòsit.
El sistema, per tant, no només veu el punt de consigna sol·licitat. Detecta com responen les diferents zones mesurades del pacient.
L’ordinador ajusta el gradient de temperatura del dipòsit i la velocitat de descens per mantenir aquestes lectures dins del límit permès pel protocol.
Un cos gran no pot ser perfectament isotèrmic durant el refredament. L’objectiu pràctic és minimitzar la dispersió i evitar que cap zona mesurada avanci o retrocedeixi de manera perillosa.
La geometria del dipòsit també redueix la manipulació entre el refredament controlat i l’emmagatzematge criogènic. La mateixa forma tancada pot proporcionar un entorn estable i simètric al voltant del pacient.
La temperatura de consigna no és la temperatura del pacient
Un controlador pot refredar l’entorn amb rapidesa. No pot fer que el centre d’un cos humà coincideixi immediatament amb aquesta temperatura.
La calor ha de viatjar des dels teixits més profunds cap a la superfície. La geometria, la composició corporal, la distribució del crioprotector i la posició dels sensors afecten el retard observat.
Per això un únic sensor a la cambra no és suficient. Un entorn nominal de -130°C no demostra que totes les parts mesurades del pacient hagin assolit -130°C.
El sistema de control ha de tenir en compte tant la temperatura absoluta com la diferència entre canals. La zona més lenta, la més ràpida i la dispersió general aporten informació.
La calibració, la col·locació i la continuïtat dels termoparells també importen. Les lectures implausibles o els falles dels sensors s’han de senyalitzar en comptes de promitjar-les silenciosament en la corba.
El programa de temperatura en tres etapes de Tomorrow.bio
L’actual protocol té tres fases ben diferenciades. Els valors són objectius operatius per a aquest equip i aquest enfocament crioprotector, no constants universals per a tots els sistemes de vitrificació.
1. Descens ràpid cap a -130°C
La primera fase mou el pacient des de la temperatura del gel sec fins a aproximadament -130°C tan ràpidament com la dispersió de temperatura mesurada ho permeti sense risc.
La velocitat és important aquí perquè les regions poc protegides encara poden formar gel abans que el teixit esdevingui semblant al vidre.
L’ordinador no segueix únicament el temps transcorregut. Monitora els termoparells i ajusta l’entorn de refredament al voltant del pacient.
2. Permetre un rebot controlat cap a -120°C
Un cop s’hagi assolit aproximadament -130°C, el refredament actiu es redueix i al pacient se li permet que s’escalfi de manera natural fins a aproximadament -120°C.
Aquesta és una fase d’annealing. Prop de Tg, el material crioprotegit conserva prou mobilitat molecular perquè alguns estressos mecànics acumulats puguin relaxar-se.
La recuperació també dona temps als regions més càlides i més fredes per acostar-se entre elles abans que el material s’endinsi en el seu estat rígid i vitri.
L’annealing no inverteix els danys biològics preexistents. El seu objectiu és més limitat: reduir els gradients tèrmics i els estressos creats per la contracció desigual.
3. Baixa fins a -196°C a aproximadament 1°C per hora
Des d’unes -120°C, el descens objectiu és d’aproximadament 1°C per hora fins que el pacient assoleixi la temperatura de nitrogen líquid.
Aquell interval final de 76 graus triga aproximadament tres dies, fins i tot abans de comptar les pauses i els ajustaments de control.
Mantenir 1°C per hora en un cos gran i heterogeni des del punt de vista tèrmic és un problema de control, no simplement una configuració de temporitzador.
El controlador ha d’ajustar contínuament l’entorn del recipient de manera que els termoparells interns baixin junts sense crear gradients excessius.
Quan una regió va amb retard, forçar l’entorn a refredar-se més pot sobre-refredar-ne una altra. La precisió significa equilibrar tot el camp de sensors, no perseguir una sola lectura.
Per què la fase d'annealing és científica i plausible
La recerca en vitrificació a gran escala identifica dues zones de fallada competidores: refredament insuficient per sobre de Tg i estrès mecànic excessiu al voltant i per sota de Tg.
Un2024 estudi de vitrificació a escala d'òrgan humà va utilitzar múltiples sondes internes i va concloure que l'annealing redueix els gradients abans que el material entri en la fase vítria.
L'estudi va trobar que refredar lentament per sota de la regió d'annealing ajuda a evitar reconstruir grans gradients i estrès.
Per separat,la recerca termomecànica va trobar que l'annealing proper a Tg canvia substancialment l'estrès residual i debilita la seva dependència respecte de la taxa de refredament precedent.
Aquests estudis donen suport a l'estratègia de control subjacent. No validen de manera independent cada punt exacte en el protocol de cos sencer de Tomorrow.bio.
Els cossos humans sencers són més grans i més heterogenis que les solucions de laboratori o els òrgans. Calen registres de temperatura directes i imatges posteriors al refredament.
Allò que enregistra l'ordinador
La sortida útil no és un missatge que digui 'refredament complet'. És la sèrie temporal completa de cada canal de temperatura.
El registre hauria de mostrar taxes, sostinguts, rebots, gradients entre sensors, accions del controlador, alarmes i qualsevol desviació respecte a la corba planificada.
Aquestes dades formen part de laavaluació de la qualitat de la criopreservació.
Després del refredament, una TC estandarditzada a temperatura de nitrogen líquid pot buscar la distribució del crioprotector, gel, deformacions greus i fractures que les dades de temperatura per si soles no poden revelar.
Per què acabar a temperatura de nitrogen líquid
A pressió atmosfèrica normal, el nitrogen bull prop de 77.34 kelvin, aproximadament -195.8°C, segons elNIST Chemistry WebBook.
L'emmagatzematge amb nitrogen líquid és passiu. Mentre hi hagi prou líquid al recipient, el seu equilibri d'ebullició manté un entorn criogènic estable sense refrigeració mecànica.
El descens controlat només acaba quan el pacient està tèrmicament preparat per a aquest estat estable. L'emmagatzematge no s'utilitza com a substitut del refredament.
El disseny i els compromisos de la següent etapa estan coberts adewars criogènics moderns i emmagatzematge a temperatura intermèdia.
TL;DR: Tomorrow.bio utilitza refredament controlat per ordinador i sensors interns de temperatura. El procés refreda ràpidament prop de la formació de vidre, alleuja l'estrès tèrmic, i després baixa lentament cap a -196°C.
Explora aquesta eina pràctica
Fes servir l'eina interactiva per examinar la qüestió d'aquest article.
Carregant l'eina interactiva...
Lectures addicionals